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       龍膽為龍膽科植物條葉龍膽Gentiana manshurica Kitag.、龍膽G.scabra Bunge、三花龍膽G.triflora Pall.或堅(jiān)龍膽G.rigescens Franch. 的干操根及根莖，具有清熱燥濕、瀉肝膽火的功效，主治濕熱黃疽、陰腫陰癢、帶下、強(qiáng)中、濕疹搔癢、目赤等癥。龍膽除含有裂環(huán)環(huán)烯醚萜類和環(huán)烯萜類化合物外，還含有生物堿、揮發(fā)油、多糖等成分。目前多糖提取文要采用傳統(tǒng)水浸提取法，該方法存在費(fèi)時(shí)長(zhǎng)、耗能多的缺點(diǎn)。有文獻(xiàn)報(bào)道將超聲波應(yīng)用于對(duì)中藥苷類成分的提取中可以提高苷類的提出率并縮短提取時(shí)間。初步藥理實(shí)驗(yàn)表明，龍膽多糖有一定的免疫增強(qiáng)作用。本研究考察超聲波在龍膽多糖的提取中應(yīng)用的可行性，對(duì)實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行優(yōu)化，并和傳統(tǒng)水提法進(jìn)行比較。

1　儀器與試藥

　　UV-2102C型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，尤尼柯（上海）儀器有限公司；JP600G型超聲波提取罐，武漢嘉鵬電子有限公司。試劑均為AR級(jí)。龍膽藥材購(gòu)自哈爾濱三棵樹(shù)藥材市場(chǎng)，經(jīng)我院中藥鑒定室沈志濱副教授鑒定為條葉龍膽。

2　方法與結(jié)果

2.1　超聲波提取龍膽多糖：稱取一定質(zhì)量龍膽粉末，加入蒸餾水適量，分別用一定頻率的超聲波超聲處理，提取液濾過(guò)、濃縮、去蛋白、乙醇沉淀，得粗品多糖，真空干燥，即得。

2.2　龍膽多糖的測(cè)定

2.2.1　葡萄糖對(duì)照品溶液的制備：精密稱取105℃ 干燥至恒重的葡萄糖100mg，置于100mL量瓶中，加入蒸餾水至刻度，搖勻，備用。

2.2.2　龍膽多糖供試品液的制備：精密稱取干燥至恒重的龍膽多糖23.80mg，置于100mL量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻即得。

2.2.3　苯酚溶液的制備：取苯酚100g，加鋁片0.1 g與碳酸氫鈉0.05g，蒸餾收集18℃餾分，稱取此餾分10g，加水150g,置于棕色瓶中備用。

2.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：吸取葡萄糖對(duì)照品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mL置于50mL量瓶中，加入蒸餾水至刻度，搖勻。精密吸取各溶液2mL于 10mL具塞刻度試管中，分別加入5％苯酚溶液1 mL，搖勻。迅速加入5mL濃硫酸，振搖5min，定容，置沸水浴中加熱15min,然后置冷水浴中冷卻 30min，定容，隨行空白，在490nm處測(cè)定吸光度。數(shù)據(jù)經(jīng)回歸處理后，得回歸方程：A=12.886 C+0.001 5，r＝0.999 7。

2.2.5　換算因子的測(cè)定：精密量取多糖供試品溶液 0.5mL，按照“標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制”項(xiàng)下的方法測(cè)定吸光度值，計(jì)算葡萄糖的質(zhì)量濃度，得換算因子f= 5.418 5。

2.2.6　多糖的測(cè)定：精密稱取各樣品溶液1mL，分別置于10mL具塞刻度試管中，按照“標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制”項(xiàng)下方法測(cè)定吸光度值，按下式計(jì)算樣品中多糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

C·D·f

多糖=——————×100％

W

　　式中C為樣品溶液的葡萄糖的質(zhì)量，D為樣品溶液的稀釋倍數(shù)，f為換算因子,W為樣品的質(zhì)量 

2.3　超聲波法提取多搪的單因素考察

2.3.1　超聲時(shí)間對(duì)多糖提取的影響：稱取相同質(zhì)量龍膽粉末5份，加入蒸餾水適量后分別用一定頻率的超聲波超聲處理15、30、45、60、75、90、120min, 后處理同2.1。結(jié)果見(jiàn)圖1?？芍?，超聲提取75min 時(shí)提出量很高，多糖提出率可達(dá)14.4％。而后隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，龍膽多糖的提取率無(wú)多大變化，并有緩慢下降之趨勢(shì)。

圖1　提取時(shí)間對(duì)多糖得率的影晌

Fig.1 Effect of extracting time on polyssacharide yield

2.3.2 pH值對(duì)多搪提取的影響：稱取相同質(zhì)量龍膽粉5份，分別加入蒸餾水適量，然后分別調(diào)節(jié)pH 為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，超聲處理75min，后處理同2.1。結(jié)果見(jiàn)圖2,可知，超聲提取pH值為7時(shí)提取率很高，粗多糖提出率可達(dá)14.2％。

圖2　pH　值對(duì)多糖得率的影晌

Fig.2 Effect of pH value on polyssacharide yield

2.3.3　加入蒸餾水量對(duì)多糖提取的影響：稱取相同質(zhì)量龍膽粉5份，分別按藥材量與蒸餾水質(zhì)量體積比為1:20、1:40、1:60、1:80、1:100加入蒸餾水，超聲處理75min，后處理同2.1。結(jié)果見(jiàn)圖3?？芍?，超聲提取加入蒸餾水量為龍膽粉：蒸餾水(1： 60)時(shí)提取率很高，粗多糖提出率可達(dá)14.1％。

2.4　提取條件的優(yōu)化：在單因素考察的基礎(chǔ)上，稱取相同質(zhì)量的龍膽粉9份，分置于9個(gè)燒杯中，選用 L9<34）正交表進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果見(jiàn)表1。正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在龍膽粉末中加入60體積的水，在pH 7.0的條件下用超聲波提取75min得到的龍膽多糖的量很大。根據(jù)很差分析結(jié)果，影響龍膽多糖提出率的3個(gè)因素中（pH、提取時(shí)間、加水量）以提取時(shí)間影響很大，其次是加水量，影響很小的是pH。

圖3　水體積對(duì)多精收率的影響

Fig.3 Effect of water volume on polyssacharide yield

表1 L9(34)正交優(yōu)選設(shè)計(jì)及結(jié)果

Table 1 L9(34）orthogonal design and result

s

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A超聲時(shí) B pH值 C加入蒸餾 D 多糖

試驗(yàn)號(hào) 間/min 水量/倍 (空白) /%

——————————————————————————

1 1(60) 1(6.0) 1(40) 1 1452

2 1 2(7.0) 2(60) 2 1737

3 1 3(8.0) 3(80) 3 1581

4 2(75) 1 2 3 1560

5 2 2 3 1 1481

6 2 3 1 2 1392

7 3(90) 1 3 2 1492

8 3 2 1 3 1429

9 3 3 2 1 1385

K1 0.4770 0.4504 0.4273

K2 0.4433 0.4647 0.4682

K3 0.4306 0.4358 0.4554

k1 0.1590 0.1501 0.1424

k2 0.1478 0.1549 0.1561

k3 0.1435 0.1453 0.1518

R 0.0155 0.0096 0.0137

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2.5　傳統(tǒng)方法提取與精制龍膽多糖：將干燥粉碎后的龍膽生藥樣品稱取100g,用500mL石油醚回流脫脂2次，每次1h。回收石油醚，藥渣揮干溶劑后用 80％乙醇500mL浸漬過(guò)夜，回流提取2次，每次 2h。濾過(guò)，將藥渣用2500mL蒸餾水90℃溫浸提取60min，再用500mL蒸餾水90℃重復(fù)溫浸提取 60min，濾過(guò)，合并濾液。將此溶液減壓濃縮至200 mL用氯仿萃取多次以除去蛋白質(zhì)，再加1％活性炭脫色2次，濾過(guò)，濾液加入95％乙醇使乙醇的體積分?jǐn)?shù)達(dá)到80％，靜置過(guò)夜，殘?jiān)来斡?5％乙醇、無(wú)水乙醇、丙酮、乙醚多次洗滌，真空干燥，得精制龍膽多糖。與超聲提取的結(jié)果比較，見(jiàn)表2。

3　討論

3.1 超聲波法提取龍膽多糖時(shí)，超聲時(shí)間不宜過(guò)

表2　兩種提取方法結(jié)果比較(n=5)

Table 2 Comparison of two extracting methods(n=5)

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方法　 粗多糖/g 提取率/% 多糖/%

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水提　0.152±0.021 15.20±2.10 19.80±1.57

超聲 0.168±0.022 16.80±2.20* 28.19±1.52**

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與水提相比較：*P＞0.05 **P＜0.05

*P＞0.05 **P＜0.05 vs water extracting 長(zhǎng)。超聲處理75min時(shí)提取率達(dá)到很大，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，提取率反而下降。原因可能是由于超聲波具有較強(qiáng)的剪切作用，長(zhǎng)時(shí)間的作用會(huì)使大分子的多糖斷裂，從而在后處理的過(guò)程中的損失加大而影響多糖的提出率。

3.2 龍膽多糖的組成十分復(fù)雜，由多種單糖組成。目前常用的測(cè)定方法是蒽酮-硫酸比色法和苯酚- 硫酸比色法。但在實(shí)際工作中，特別是在測(cè)定天然產(chǎn)物中的糖測(cè)定時(shí)，測(cè)得的結(jié)果與實(shí)際情況不符。原因是這兩種方法都是以葡萄糖作為對(duì)照，這對(duì)含有多種單糖的天然多糖來(lái)說(shuō)必將使測(cè)量值與實(shí)際值不符。本實(shí)驗(yàn)中有將近70％的產(chǎn)物未被檢出，這是在多糖測(cè)定方法的研究中經(jīng)常遇到的問(wèn)題。如果在制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)能夠根據(jù)多糖的組成，用多種單糖適當(dāng)混合后作為對(duì)照，就可以在一定程度上改善這種情況。

3.3 植物多糖作為免疫增強(qiáng)劑已引起人們的廣泛關(guān)注，臨床用于腫瘤病人的治療已取得較好療效。龍膽多糖可否作為免疫增強(qiáng)藥物應(yīng)進(jìn)一步深入研究。 （中草藥第36卷第6期 江蔚新，朱正蘭）

　　產(chǎn)品型號(hào)：JP600G型超聲波提取/乳化機(jī)組

　　機(jī)型結(jié)構(gòu)：超聲波發(fā)生器與提取罐分體式

　　超聲頻率：28KHz

　　超聲峰值功率：1000W （由原600W升級(jí)至1000W，價(jià)格不變）

　　提取罐內(nèi)尺寸：直徑320 ×高250mm

　　提取罐容積：小于等于20L

　　攪拌電機(jī)功率：15W

　　攪拌電機(jī)轉(zhuǎn)速：10-30轉(zhuǎn)/min（可調(diào)）

　　電加熱功率：2KW

　　供電電源：220VAC 50HZ 

　　具有數(shù)顯時(shí)鐘可調(diào)功能

　　具有數(shù)顯功率可調(diào)功能

　　具有數(shù)顯掃頻可調(diào)功能

　　具有數(shù)顯溫度可調(diào)功能

　　武漢嘉鵬電子有限公司專業(yè)致力于超聲波提取/萃取、超聲波乳化、超聲波清洗、超聲波污水處理、超聲波酒類醇化產(chǎn)品的研發(fā)、生產(chǎn)及銷(xiāo)售。公司擁有多項(xiàng)技術(shù)。其中“數(shù)字式大功率多用途超聲波電源系統(tǒng)”獲武漢市重大科技成果獎(jiǎng)。數(shù)字掃頻實(shí)現(xiàn)了用戶迫切需要的變頻要求的同時(shí)還彌補(bǔ)了早期雙頻或多頻技術(shù)帶來(lái)的超聲轉(zhuǎn)換效率很低的弊端。此項(xiàng)技術(shù)經(jīng)由全國(guó)各大院校的用戶使用后反應(yīng)很好。應(yīng)用于植物提取、乳化、污水處理等領(lǐng)域，院校包括：清華大學(xué)、北京大學(xué)、浙江大學(xué)、華中科技大學(xué)、武漢大學(xué)、華中師大、中國(guó)地質(zhì)大學(xué)、武漢科技大學(xué)、上海交大、浙江工業(yè)大學(xué)、蘭州大學(xué)、河南農(nóng)業(yè)大學(xué)、武漢化工學(xué)院、吉林大學(xué)、四川大學(xué)、華南理工大學(xué)、華東理工大學(xué)、江漢大學(xué)、長(zhǎng)江大學(xué)、中科院武漢植物所、昆明植物所、中科院過(guò)程所、中科院武漢物理所、武漢市藥檢所等。公司產(chǎn)品行銷(xiāo)全國(guó)除港、澳、臺(tái)外的所有省份及直轄市。售后方面：公司產(chǎn)品使用自主技術(shù)故性能穩(wěn)定、質(zhì)量很好。公司承諾5年內(nèi)免費(fèi)質(zhì)保。用戶采用超聲波需注意的事項(xiàng)：超聲波提取方面：一、被提取物需粉碎到20目或更細(xì)。粉碎越細(xì)得率越高。二、選用合適的提取溶劑。三、根據(jù)產(chǎn)品的特性和產(chǎn)量合理的安排提取工藝。

　　超聲波乳化方面：一、乳化液的配方包括乳化劑的用量。二、乳化時(shí)間的選定，并不是時(shí)間長(zhǎng)就越好，乳化過(guò)程是分散和聚合不停的循環(huán)的過(guò)程。按現(xiàn)有試驗(yàn)結(jié)果顯示10－15分鐘的乳化粒徑可達(dá)100納米。

　　重要的是數(shù)字掃頻的選擇，此項(xiàng)共有16檔選擇，數(shù)值越低則氣泡越粗、力量越大；數(shù)值越高則氣泡越細(xì)、力量越小。不同的提取或乳化物質(zhì)改變數(shù)字掃頻會(huì)帶來(lái)不同的效果及效率。

　　超聲波提取天然產(chǎn)物包括超聲波提取多肽、氨基酸、核酸、各種酶類、單糖、寡糖、多糖、糖蛋白、樹(shù)脂、膠體物、木質(zhì)素、維生素、脂肪、油脂、蠟、生物堿、揮發(fā)油、黃酮、糖苷類、苯丙素類、有機(jī)酸、酚類、醌類、甾體化合物、抗生素類等。